La duquesa de Malfi tiene lugar en Italia, principalmente en el palacio de la duquesa de Malfi, en el siglo XVI. La duquesa es una joven viuda cuyos dos hermanos, Fernando y el cardenal, la visitan desde Roma al comienzo de la obra. Antonio, el administrador de su casa, acaba de regresar de Francia. Antes de dejar a la duquesa, Ferdinand contrata a Bosola, previamente utilizada por el cardenal como asesino a sueldo, para administrar aparentemente los caballos de la duquesa, pero en realidad para espiarla para los hermanos para que puedan estar seguros de que sigue siendo casta y no se vuelve a casar. Bosola se muestra reacio, pero finalmente acepta.
Antes de regresar a Roma, Fernando y el cardenal le dan una conferencia a la duquesa sobre lo indebido de volverse a casar. Ella insiste en que no tiene planes de volver a casarse y muestra cierta irritación por sus intentos de controlarla. Sin embargo, en cuanto se van, ella pone en marcha un plan para proponerle matrimonio a Antonio con la ayuda de su criada, Cariola. Antonio y la duquesa se casan, y la duquesa le asegura a Antonio que encontrarán la manera de apaciguar a sus hermanos.
El segundo acto se establece unos nueve meses después. La duquesa está embarazada y Bosola, sospechando su condición, trama un plan para demostrárselo a sí mismo dándole albaricoques, que se cree que inducen el parto. Ella los acepta e inmediatamente se enferma, y se apresura a ir a su dormitorio. Antonio y Delio discuten cómo mantener su trabajo en secreto.
Bosola ahora asume que su creencia es correcta, pero encuentra más pruebas definitivas a través de un horóscopo que Antonio escribió para el bebé. Con la información confirmada, Bosola escribe una carta a los hermanos de la duquesa para contarles la noticia. Los dos hermanos están indignados, pero el cardenal mantiene una calma fría, mientras que Ferdinand se enoja erráticamente. Ninguno de los dos se da cuenta de que está casada y, por lo tanto, asume que el bebé es un bastardo. Ferdinand dice que no tomará ninguna medida hasta que sepa quién es el padre del bebé.
El tercer acto comienza unos dos años después, con el regreso de Delio al palacio de la duquesa. Antonio y la duquesa han tenido dos hijos más mientras tanto. Ferdinand ha llegado recientemente, y tanto Antonio como Delio sospechan que él sabe sobre los hijos de la duquesa. Ferdinand sorprende a la duquesa en su dormitorio, y cuando ella le dice que está casada, él le dice que nunca debe revelarle el nombre de su amante para que no se desate una terrible violencia sobre todos ellos. Además, la destierra para siempre de su vista.
La duquesa, que desea proteger a Antonio sacándolo de Malfi, afirma falsamente que le ha robado y, por lo tanto, lo ha desterrado a Ancona. Una vez que se ha ido, Bosola defiende su virtud ante la duquesa de forma tan enfática que ella confiesa el secreto de su matrimonio. Bosola finge apoyarla, y ella lo envía a buscar a Antonio con dinero y noticias de que pronto lo seguirá. En Ancona, unos días después, el Cardenal los alcanza y desterra a la Duquesa y su familia de allí.
Al salir de la ciudad, Bosola le trae una carta aparentemente indulgente pero en realidad amenazante de Fernando, por lo que la duquesa, temiendo una emboscada, le dice a Antonio que se separe de ella con su hijo mayor. Inmediatamente después de separarse, Bosola y un grupo de soldados toman cautivos a la duquesa y a los dos hijos restantes y los llevan de regreso a su palacio.
En el cuarto acto, Bosola le dice a Ferdinand que la duquesa está soportando su encarcelamiento con nobleza, lo que lo enfurece. En un esfuerzo por volverla loca de desesperación, le presenta los cadáveres de cera de su familia para convencerla de que han muerto. Aunque Bosola le suplica a Ferdinand que cese su tortura, él no escucha y envía a un grupo de locos a atormentarla. Bosola regresa, disfrazado de constructor de tumbas, y prepara a la duquesa para su muerte inminente. Los verdugos la siguen con una cuerda para estrangularla, pero la duquesa permanece firme y tranquila y valiente, en paz con la idea de reunirse con su familia, que todavía cree que está muerta. La estrangulan.
A continuación, Bosola ordena matar a sus hijos y a Cariola. Cariola suplica por su vida, sin éxito. Cuando Ferdinand se enfrenta al cuerpo de la duquesa, de repente se siente arrepentido y enojado con Bosola por seguir sus órdenes. No solo traiciona a Bosola negándole la recompensa prometida, sino que también muestra signos de locura antes de salir. La duquesa muestra un último signo de vida, y antes de morir realmente, Bosola le dice que Antonio sigue vivo. Bosola muestra verdadera tristeza cuando muere.
En el quinto acto, Antonio, ignorante de la muerte de su esposa e hijos, planea suplicar esa noche al cardenal una reconciliación. Ferdinand ahora ha perdido completamente la cabeza y está afligido por la licantropía, o la creencia de que es un lobo.
Llega Bosola y el cardenal finge no tener idea de la muerte de la duquesa. Le ofrece a Bosola una gran recompensa por el asesinato de Antonio, una oferta que Bosola acepta a pesar de que está tramando venganza. Julia, la amante del cardenal, se acerca a Bosola y le declara su amor, y Bosola la usa para que el cardenal admita su participación en el asesinato de la duquesa.
Después de que el cardenal mata a Julia, Bosola revela que ha escuchado el secreto y exige su recompensa por matar a la duquesa. El Cardenal, una vez más, promete que vendrá después de que haya matado a Antonio y lo haya ayudado a deshacerse del cuerpo de Julia. Bosola finge estar de acuerdo, pero le dice a la audiencia que encontrará a Antonio para protegerlo o ayudarlo a vengarse del Cardenal y Ferdinand.
El Cardenal les dice a sus cortesanos que se mantengan alejados sin importar lo que escuchen de él o de Ferdinand, aparentemente porque la locura de Ferdinand empeora cuando hay gente cerca, pero en realidad porque quiere privacidad con la que deshacerse del cuerpo de Julia. Bosola, esperando fuera de la habitación del Cardenal, mata accidentalmente a Antonio, que ha venido a ver al Cardenal. Angustiado, entra en la habitación del Cardenal y lo ataca.
Debido a la advertencia del Cardenal, sus cortesanos al principio ignoran sus gritos de ayuda. Ferdinand se une a la refriega y apuñala tanto al cardenal como a Bosola. Bosola mata a Ferdinand. Los cortesanos finalmente entran a tiempo para ver morir al cardenal y a Bosola, pero no antes de que este último haya confesado los pormenores de la situación. Delio entra con Antonio y el hijo mayor de la duquesa, que es el único superviviente de la familia. Delio y los cortesanos prometen criar al niño como un legado a sus padres, lo que le da a la obra un último rayo de esperanza.
